簡(jiǎn)要描述:活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等,參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。
產(chǎn)品分類
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品牌 | Life-iLab/李記生物 | 貨號(hào) | AC12L925 |
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規(guī)格 | 100T | 供貨周期 | 現(xiàn)貨 |
應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
產(chǎn)品描述
活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等,參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程。李記生物的活性氧檢測(cè)試劑盒(Meilun Reactive Oxygen Species Assay Kit)是一種基于熒光染料DCFH-DA (2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate) 的熒光強(qiáng)度變化,定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的常用方法。
DCFH-DA本身沒(méi)有熒光,可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜,從而使探針很容易被標(biāo)記到細(xì)胞內(nèi)。在活性氧存在的條件下,DCFH被氧化生成熒光物質(zhì)DCF,綠色熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比,檢測(cè)DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。在激發(fā)波長(zhǎng)502 nm,發(fā)射波長(zhǎng)530 nm附近,使用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀等檢測(cè)DCF熒光,從而測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。
本試劑盒背景低、靈敏度高、線性范圍寬、使用方便,可用于各種真核培養(yǎng)細(xì)胞的檢測(cè),且提供了活性氧陽(yáng)性對(duì)照試劑Rosup,便于活性氧的檢測(cè)。以96孔板每孔加樣量為標(biāo)準(zhǔn),本試劑盒可測(cè)定約100次。
訂購(gòu)信息
產(chǎn)品名稱 | 貨號(hào) | 規(guī)格 |
活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒 | AC12L925 | 100T |
產(chǎn)品組分
組分 | 規(guī)格 |
A. DCFH-DA (10mM) | 0.1 mL |
B. 活性氧陽(yáng)性對(duì)照(Rosup, 50mg/mL) | 1 mL |
運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存,有效期12個(gè)月。
使用方法
一、裝載探針
刺激時(shí)間較短(通常為2 h以內(nèi))的細(xì)胞:先裝載探針,后用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞。
刺激時(shí)間較長(zhǎng)(通常為6 h以上)的細(xì)胞:先用活性氧陽(yáng)性對(duì)照或自己感興趣的藥物刺激細(xì)胞,后裝載探針。
1. 原位裝載探針(僅適用于貼壁細(xì)胞)
(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備:檢測(cè)前一天進(jìn)行細(xì)胞鋪板,確保檢測(cè)時(shí)細(xì)胞匯合度達(dá)到50~70%。【注】:必須保證細(xì)胞狀態(tài)健康,且檢測(cè)時(shí)不會(huì)過(guò)度生長(zhǎng)。
(2) 探針準(zhǔn)備:探針裝載前按照1:1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μM。
(3) 探針裝載:吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA 工作液。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜,【例】:6 孔板通常不少于1000 μL;96 孔板通常不少于100 μL。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20~30 min。
(4) 細(xì)胞清洗:用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
(5) 藥物誘導(dǎo):加入適量經(jīng)合適的緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育,具體誘導(dǎo)時(shí)間根據(jù)藥物本身特性,以及細(xì)胞類型來(lái)決定。
(5)(可選)陽(yáng)性對(duì)照:先用無(wú)血清培養(yǎng)基等1:1000 稀釋陽(yáng)性對(duì)照(Rosup, 50mg/ml)到常用工作濃度100 μg/ml,加入細(xì)胞,一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高,但依細(xì)胞類型會(huì)有比較明顯差異。(如,HeLa 細(xì)胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h)
2. 收集細(xì)胞后裝載探針(適用于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞)
(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備:按照標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)細(xì)胞,必須保證檢測(cè)用細(xì)胞狀態(tài)健康。按照適當(dāng)方法,清洗并收集足量的細(xì)胞。
(2) 探針準(zhǔn)備:探針裝載前,按照1:1000 用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA,使其終濃度為10 μM。
(3) 探針裝載:細(xì)胞收集后懸浮于加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA 工作液,使其細(xì)胞密度為1.0×106~2.0×107/mL,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育20~30 min,每隔3-5 min 顛倒混勻一下,使探針和細(xì)胞充分接觸?!咀ⅰ浚杭?xì)胞密度需根據(jù)后續(xù)的檢測(cè)體系,檢測(cè)方法,以及檢測(cè)總量來(lái)進(jìn)行調(diào)整。【例】:對(duì)于流式分析,單管檢測(cè)內(nèi)細(xì)胞數(shù)目不少于104,也不可多于106。
(4) 細(xì)胞清洗:用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次,以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA。
(5) 藥物誘導(dǎo):將細(xì)胞懸浮于適量經(jīng)合適的緩沖液或無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋到工作濃度的藥物中,或把細(xì)胞等分成若干份后進(jìn)行藥物刺激,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育,具體誘導(dǎo)時(shí)間按藥物本身特性,以及細(xì)胞類型來(lái)決定。
(5)(可選)陽(yáng)性對(duì)照:先用無(wú)血清培養(yǎng)基等1:1000 稀釋陽(yáng)性對(duì)照(Rosup, 50mg/ml)到常用工作濃度100 μg/ml,加入細(xì)胞,一般37℃避光孵育20~30 min 可顯著看到活性氧水平提高,但依細(xì)胞類型會(huì)有比較明顯差異。(如,HeLa 細(xì)胞孵育30 min;MRC5人胚胎成纖維細(xì)胞1.5 h)
二、檢測(cè)
原位裝載探針?lè)ǎ杭す夤簿劢癸@微鏡直接觀察,或收集細(xì)胞后用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
收集細(xì)胞后裝載探針:用熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè),也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。
三、參數(shù)設(shè)置
使用488 nm 激發(fā)波長(zhǎng),525 nm 發(fā)射波長(zhǎng),實(shí)時(shí)或逐時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)刺激前后熒光的強(qiáng)弱。DCF 的熒光光譜和FITC 非常相似,可以用FITC 的參數(shù)設(shè)置檢測(cè)DCF。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考下圖。
四、其他事項(xiàng)說(shuō)明
1. 陽(yáng)性對(duì)照Rosup通常按照1:1000的比例使用。通常刺激后20~30 min可以觀察到顯著的活性氧水平升高。對(duì)于不同的細(xì)胞,活性氧陽(yáng)性對(duì)照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30 min內(nèi)觀察不到活性氧的升高,可延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)提高活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。如果活性氧升高得過(guò)快,可縮短誘導(dǎo)時(shí)間或適當(dāng)降低活性氧陽(yáng)性對(duì)照的濃度。
2. 對(duì)于某些細(xì)胞,若沒(méi)有刺激的陰性對(duì)照細(xì)胞熒光也比較強(qiáng),可以按照1:2000~1:5000稀釋DCFH-DA,使裝載探針時(shí)DCFH-DA 的濃度為2~5 μM。探針裝載的時(shí)間也可以根據(jù)情況在15~60 min內(nèi)適當(dāng)進(jìn)行調(diào)整。
3. 活性氧陽(yáng)性對(duì)照(Rosup)僅僅用于作為陽(yáng)性對(duì)照的樣品,并不是在每個(gè)樣品中都需加入活性氧陽(yáng)性對(duì)照。
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
2. 探針裝載后,一定要洗凈殘余的未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針,否則會(huì)導(dǎo)致背景較高。
3. 探針裝載完畢并洗凈殘余探針后,可以進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)的掃描和發(fā)射波長(zhǎng)的掃描,以確認(rèn)探針的裝載情況是否良好。DCF 的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜請(qǐng)參考上頁(yè)圖譜。
4. 盡量縮短探針裝載后到測(cè)定所用的時(shí)間(刺激時(shí)間除外),以減少各種可能的誤差。
本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
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