簡(jiǎn)要描述:《Quick Cell探針?lè)ㄖгw檢測(cè)試劑盒》采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針(報(bào)告基因?yàn)镕AM),用于對(duì)樣品的支原體基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)??捎糜跈z測(cè)一切可能含支原體的樣品,比如:體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清、血清、各種體液(如唾液、尿液、鼻腔分泌物)、別的液體樣品。
產(chǎn)品分類
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品牌 | 其他品牌 | 貨號(hào) | AC16L068 |
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 生物產(chǎn)業(yè) |
Quick Cell探針?lè)ㄖгw檢測(cè)試劑盒(Quick Cell qPCR Mycoplasma Detection Kit with Probe)采用支原體特異性引物和支原體特異性熒光探針(報(bào)告基因?yàn)?span>FAM),用于對(duì)樣品的支原體基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增檢測(cè)。試劑盒內(nèi)同時(shí)含有內(nèi)參對(duì)照質(zhì)粒mycoIC2和相應(yīng)的引物和熒光探針(報(bào)告基因?yàn)?span>VIC),用于監(jiān)控支原體DNA提取和qPCR擴(kuò)增的效率。本試劑盒可用于檢測(cè)一切可能含支原體的樣品,比如:體外細(xì)胞培養(yǎng)的上清、血清、各種體液(如唾液、尿液、鼻腔分泌物)、別的液體樣品。
經(jīng)多次測(cè)試,本試劑盒有記錄可以識(shí)別在體外細(xì)胞培養(yǎng)中曾經(jīng)報(bào)道出現(xiàn)的20種支原體。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,這些支原體基本上占污染細(xì)胞的支原體種類的100%。具體如下:(1)M. hyorhinis、(2)M. fermentans、(3)M. arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)A. laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M. bovis、(11) M. bovoculi、(12)A. axanthum、(13)M. buccale、 (14) M. pneumoniae、(15)M. arthritidis、(16)M. pulmonis、(17)M. gallisepticum、(18)M. gallinarum、(19)M. canis、(20)Ureaplasma urealyticum(M.為Mycoplasma的縮寫;A.為Acholeplasma的縮寫)。
訂購(gòu)信息
產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) | 規(guī)格 |
Quick Cell探針?lè)ㄖгw檢測(cè)試劑盒 | AC16L068 | 50T |
產(chǎn)品組分
產(chǎn)品組分 | 規(guī)格 |
探針?lè)ㄈ芤?span>1P(50T) | 550 μL,含支原體和內(nèi)參檢測(cè)用引物及熒光探針 |
探針?lè)ㄈ芤?span>2T(50T)
| 50 μL,酶溶液 |
內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2 | 500 μL |
去離子水 | 1.2 mL |
陽(yáng)性支原體DNA | 50 μL |
注:①本試劑盒由于含有內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2(用于監(jiān)控支原體DNA提取和qPCR擴(kuò)增的有效性),客戶可以選擇進(jìn)行樣品支原體DNA的提?。▋?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2在支原體DNA提取過(guò)程中加入),也可以選擇不進(jìn)行樣品支原體DNA的提?。▋?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2在配制體系時(shí)加入)。
②本試劑盒的配套儀器可以是任何具有FAM和VIC檢測(cè)通道的熒光定量PCR儀。
運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃避光保存,有效期60個(gè)月。
使用方法
1. 待測(cè)樣品的前處理
為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染,待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品需要取自換液后培養(yǎng)2-3d且匯合度在90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)液上清(貼壁細(xì)胞)。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后,讓細(xì)胞生長(zhǎng)2-3d再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)??梢园凑找韵聝煞N方法之一進(jìn)行樣品的前處理:
1.1 方法一:對(duì)樣品進(jìn)行支原體DNA的提取
很多樣品(比如:培養(yǎng)很多天的細(xì)胞上清、血清、血漿等)由于含有抑制PCR擴(kuò)增的成分,如果樣品不進(jìn)行前處理而直接檢測(cè),有可能導(dǎo)致qPCR擴(kuò)增失?。?span>qPCR結(jié)果:支原體通道和內(nèi)參對(duì)照通道均無(wú)擴(kuò)增曲線)。該類樣品建議客戶進(jìn)行樣品DNA提取(或者離心清洗,見(jiàn)后文方法二)后,再進(jìn)行檢測(cè)。提取DNA的過(guò)程有兩個(gè)作用:(1) 基本可以去除所有抑制PCR擴(kuò)增的成分,保證后續(xù)定量PCR擴(kuò)增的正常進(jìn)行;(2)具有濃縮支原體DNA的作用,可以提高相對(duì)檢測(cè)靈敏度10-100倍。
1.2 方法二:樣品不經(jīng)DNA提取
推薦此方法。該方法不僅可以濃縮支原體從而提高相對(duì)檢測(cè)靈敏度,還可以去除絕大部分可能的抑制物,PCR擴(kuò)增被抑制的可能性極低。如果該簡(jiǎn)單一步離心清洗的方法仍然無(wú)法去除抑制物,可以使用后文注意事項(xiàng)部分的三步離心清洗的方法。具體方法如下:
(1) 根據(jù)濃縮倍數(shù),可以取100 - 1500 μL上述待測(cè)樣品到1.5 mL離心管內(nèi),在普通臺(tái)式離心機(jī)上1000 rpm (大約150 g)低速離心5 min,將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管內(nèi),丟棄細(xì)胞沉淀。
(2) 將上清繼續(xù)13000 rpm(約16000 g)高速離心10 min,小心吸走全部上清(為避免碰到底部沉淀,可以保留底部3-5 μL液體),用50μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8(樣品可以長(zhǎng)期保存)或者去離子水(樣品比較不穩(wěn)定,只適合當(dāng)天或短期內(nèi)檢測(cè)使用)重懸沉淀(沉淀中含有支原體),吹吸均勻(如果最初使用了1500 μL的樣品,則支原體濃度大約提高了30倍)。
(3) 至此,該樣品可以直接進(jìn)行檢測(cè),也可以進(jìn)行熱處理后再檢測(cè)(熱處理后,樣品保存更穩(wěn)定)。熱處理具體如下:95 ℃加熱處理5 min(可以轉(zhuǎn)移到PCR管內(nèi),在PCR儀上進(jìn)行加熱處理),簡(jiǎn)單離心(1000 g,5 sec)后,取上清進(jìn)行檢測(cè)。
注1:這里的細(xì)胞培養(yǎng)上清不是指細(xì)胞經(jīng)胰*消化后的離心上清,而是指至少培養(yǎng)2d后的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)液上清(不需要胰*消化,也不能取經(jīng)胰*消化后的離心上清進(jìn)行檢測(cè))或懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液。
注2:本步驟的低速離心是為了去除哺乳動(dòng)物細(xì)胞,以排除其不必要的干擾。所以離心力要嚴(yán)格控制在150-200 g,該離心力下,哺乳動(dòng)物細(xì)胞將被沉淀下來(lái)而支原體不會(huì)。如果錯(cuò)誤使用更高的離心力將可能導(dǎo)致支原體也被離心下來(lái),從而導(dǎo)致假陰性。
注3:收集的待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測(cè),請(qǐng)放于-20℃或-80℃冰箱保存,不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存一個(gè)月,在-80℃可以長(zhǎng)期保存。此外,為了節(jié)約檢測(cè)成本,可以將不同時(shí)間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存,而后一起檢測(cè)。
2. 熒光定量PCR體系的配制
本步驟所有操作強(qiáng)烈建議使用進(jìn)口濾芯吸頭(比如Axygen濾芯吸頭)進(jìn)行操作,以避免試劑被污染。操作之前,請(qǐng)認(rèn)真看完后文的注意事項(xiàng)后,再進(jìn)行操作:
將探針?lè)ㄈ芤?span>1P、陽(yáng)性支原體DNA、去離子水、內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2從-20 ℃冰箱中取出,放室溫融化(也可以用手握住幫助融化)。探針?lè)ㄈ芤?span>1P和探針?lè)ㄈ芤?span>2T開(kāi)蓋之前,請(qǐng)高速離心一下(5000 rpm,離心1min)。探針?lè)ㄈ芤?span>2T不能在室溫長(zhǎng)久放置(可以短時(shí)間放置5-10min),建議在-20 ℃冰箱直接吸取。
如果樣品總數(shù)為N(N=待測(cè)樣品數(shù)+1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照+1個(gè)陰性對(duì)照),待測(cè)樣品的前處理方法不同,對(duì)應(yīng)的反應(yīng)體系也不同,具體如下:
2.1樣品進(jìn)行DNA提取后的反應(yīng)體系
在DNA提取過(guò)程中,必須按說(shuō)明書加入內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2。如果提取時(shí)沒(méi)有加入內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2,則按照后文“樣品不經(jīng)DNA提取的反應(yīng)體系"進(jìn)行操作:
(1) 反應(yīng)體系:
表1. 樣品經(jīng)DNA提取后的反應(yīng)體系
單個(gè)樣品體積(μL) | 樣品總數(shù) | 總體積(μL) | |
探針?lè)ㄈ芤?span>1P | 11 | N | 11×N×1.06 |
探針?lè)ㄈ芤?span>2T | 1 | N | 1×N×1.06 |
注:總體積中多配制6%(該比例如果覺(jué)得不合適,可以自己調(diào)整),是為了防止移液誤差,以保證每個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量。
例:如果待測(cè)樣品為8個(gè)(加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照),則樣品總數(shù)為10個(gè)。探針?lè)ㄈ芤?span>1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL,探針?lè)ㄈ芤?span>2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL。
(2) 將上述2種溶液混合,吹打均勻后,按每管12 μL分裝到熒光定量PCR八聯(lián)管中。
(3) 待測(cè)樣品管加入18 μL提取好的待測(cè)樣品DNA(樣品DNA加入量不能減少,否則內(nèi)參質(zhì)粒擴(kuò)增可能失敗);陰性對(duì)照管加入2 μL內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2(吹吸均勻后加入)和16 μL去離子水(為防止去離子水被污染,此處建議使用20 μL移液槍配合200 μL吸頭進(jìn)行吸取操作);陽(yáng)性對(duì)照管加入2 μL陽(yáng)性支原體DNA(吹吸均勻后加入)和16 μL去離子水。每管反應(yīng)液的總體積為30 μL。
2.2 樣品不經(jīng)DNA提取的反應(yīng)體系:
(1) 反應(yīng)體系:
表3. 內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2統(tǒng)一在配制PCR反應(yīng)體系時(shí)加入
單個(gè)樣品體積(μL) | 樣品總數(shù) | 總體積(μL) | |
去離子水 | 14 | N | 14×N×1.06 |
探針?lè)ㄈ芤?span>1P | 11 | N | 11×N×1.06 |
探針?lè)ㄈ芤?span>2T | 1 | N | 1×N×1.06 |
內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2 | 2 | N | 2×N×1.06 |
注:總體積中多配制6%(該比例如果覺(jué)得不合適,可以自己調(diào)整),是為了防止移液誤差,以保證每個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量。
例:如果待測(cè)樣品為8個(gè)(加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照),則樣品總數(shù)為10個(gè)。去離子水的總體積為14×10×1.06=148.4 μL,探針?lè)ㄈ芤?span>1P的總體積為11×10×1.06=116.6 μL,探針?lè)ㄈ芤?span>2T的總體積為1×10×1.06=10.6 μL,內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2的總體積為2×10×1.06=21.2 μL。
(2) 將上述3種溶液混合,吹打均勻后,按每管28 μL分裝到熒光定量PCR八聯(lián)管中。
(3) 待測(cè)樣品管加入2 μL待測(cè)樣品DNA,陰性對(duì)照管加入2 μL去離子水,陽(yáng)性對(duì)照管加入2 μL陽(yáng)性支原體DNA(吹吸均勻后加入)。每管反應(yīng)液的總體積為30 μL。
(4) 蓋上熒光定量PCR八聯(lián)管蓋子,去除反應(yīng)管中的大氣泡,3000-6000 rpm離心30 sec。
注:定量PCR八聯(lián)管的封蓋,應(yīng)該佩戴全新的PE手套進(jìn)行操作,避免裸手接觸定量PCR八聯(lián)管。
3. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增:
將PCR八聯(lián)管放入熒光定量PCR儀內(nèi),設(shè)置如下實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增程序:
表3. 熒光定量PCR擴(kuò)增程序
步驟 | 作用 | 循環(huán)數(shù) | 溫度 | 時(shí)間 | 收集熒光信號(hào) |
1 | 預(yù)變性 | 1 cycle | 95 ℃ | 2 min | 否(No) |
2 | 預(yù)擴(kuò)增 (不收集熒光) | 5 cycles | 95 ℃ | 10 sec | 否(No) |
60 ℃ | 35 sec | 否(No) | |||
3 | 正式擴(kuò)增 (需要收集熒光) | 40 cycles | 95 ℃ | 10 sec | 否(No) |
60 ℃ | 35 sec | 是(Yes) |
注:支原體檢測(cè)熒光通道選擇FAM(Reporter: FAM,Quencher: None);內(nèi)參對(duì)照檢測(cè)熒光通道選擇VIC(Reporter: VIC, Quencher: None);反應(yīng)體積(Sample Volume)為30 μL;參考熒光(Passive Reference,只有ABI儀器需要設(shè)置)選擇None。
4. 結(jié)果分析:
4.1 ABI StepOne Plus 熒光定量PCR儀基線和閾值設(shè)定方法
其他熒光定量PCR儀的設(shè)置大同小異,請(qǐng)參考各自儀器說(shuō)明書進(jìn)行設(shè)置。
(1) 基線(Baseline)的設(shè)定:可以將Auto baseline前面的√ 去掉,然后手動(dòng)設(shè)置基線的起點(diǎn)為2(將剛開(kāi)始熒光值不穩(wěn)定的幾個(gè)循環(huán)排除在基線之外。如果起點(diǎn)2不合適,可以適當(dāng)增減),終點(diǎn)為10左右。
(2) 閾值(Threshold)線的設(shè)定:不同通道的閾值應(yīng)該分別設(shè)定。設(shè)定某個(gè)通道閾值線時(shí),首先選中含陰性對(duì)照的若干個(gè)樣品,去掉儀器勾選的自動(dòng)Threshold線,將其選項(xiàng)“√ Auto"改為“ Auto",然后手動(dòng)調(diào)整閾值線,以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照FAM通道擴(kuò)增曲線(無(wú)規(guī)則噪音線)的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。
4.2 實(shí)驗(yàn)有效性判斷:
陽(yáng)性對(duì)照管:其FAM通道有典型的S型擴(kuò)增曲線(即指數(shù)擴(kuò)增),其VIC通道的擴(kuò)增線呈直線或者S型曲線。
陰性對(duì)照管:其FAM通道的擴(kuò)增線呈直線,其VIC通道應(yīng)該有典型的S型擴(kuò)增曲線。
如果陽(yáng)性對(duì)照管、陰性對(duì)照管同時(shí)滿足上述條件,則說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效,否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。
典型的陰性直線型擴(kuò)增線和陽(yáng)性S型擴(kuò)增曲線如圖1所示:
圖1. 典型的陰性直線型擴(kuò)增線(左)和陽(yáng)性S型擴(kuò)增曲線(右)
4.3 待測(cè)樣品結(jié)果判斷:
待測(cè)樣品有可能出現(xiàn)以下4種組合:
表4. 待測(cè)樣品管FAM通道和VIC通道可能組合
組合 | FAM通道(測(cè)支原體) | VIC通道(測(cè)內(nèi)參) | 支原體污染判斷 |
1 | S型曲線 | S型曲線 | 支原體污染 |
2 | S型曲線 | 直線 | 支原體污染 |
3 | 直線 | S型曲線 | 無(wú)支原體 |
4 | 直線 | 直線 | PCR被抑制,結(jié)果無(wú)效 |
待測(cè)樣品管只要FAM通道有S型擴(kuò)增曲線(組合1和組合2)就說(shuō)明有支原體污染。因?yàn)橥饧拥膬?nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子數(shù)極少,如果支原體含量很大時(shí),內(nèi)參質(zhì)粒的擴(kuò)增會(huì)被抑制,導(dǎo)致內(nèi)參VIC通道無(wú)信號(hào)(組合2)。
如果待測(cè)樣品管FAM通道呈直線,而VIC通道有S型曲線(說(shuō)明樣品的DNA提取過(guò)程和PCR擴(kuò)增過(guò)程均正常)(由于提取過(guò)程中,外加的內(nèi)參質(zhì)粒mycoIC2分子數(shù)較少,作為內(nèi)參對(duì)照的VIC通道的Ct值會(huì)比較大),說(shuō)明樣品無(wú)支原體。
如果陽(yáng)性對(duì)照管和陰性對(duì)照管結(jié)果正常,而待測(cè)樣品管FAM通道和VIC通道均呈直線,說(shuō)明PCR被抑制。如果樣品是經(jīng)過(guò)提取的,最可能原因是:DNA洗脫前,吸附膜中的乙醇沒(méi)有揮發(fā)(解決方法:洗脫前,將吸附柱放50-65℃烘箱至少15min)。如果樣品是沒(méi)有經(jīng)過(guò)提取的,則樣品本身含有抑制PCR的成分(解決方法:將樣品進(jìn)行DNA提取或者離心清洗)。
注1:陽(yáng)性結(jié)果需要結(jié)合擴(kuò)增曲線(主要)和Ct值(次要)進(jìn)行判斷,不能只看Ct值(因熒光值的波動(dòng),個(gè)別陰性樣品雖然擴(kuò)增曲線基本呈直線,但可能會(huì)出現(xiàn)Ct值,此類樣品不能判斷為陽(yáng)性。反之亦然:有些樣品有S型曲線,但是因?yàn)闊晒庵挡▌?dòng),導(dǎo)致沒(méi)有Ct值,此類樣品不能判斷為陰性)
注2:無(wú)論FAM通道,還是VIC通道,只要其擴(kuò)增曲線有明顯抬升(呈現(xiàn)S型曲線趨勢(shì)),即使其Ct值在35-40范圍內(nèi),該檢測(cè)結(jié)果仍可判斷為陽(yáng)性,可以報(bào)告該Ct值。
注3:結(jié)果判斷完后,將PCR八聯(lián)管用自封袋密閉后,進(jìn)行適當(dāng)處理。
注意事項(xiàng)
1. 本產(chǎn)品主要用于細(xì)胞上清支原體污染檢測(cè),僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用,不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
2. 防DNA污染注意事項(xiàng):
(1) 強(qiáng)烈建議所有操作(特別是qPCR體系配制步驟和吸取試劑盒中試劑的時(shí)候)使用濾芯吸頭進(jìn)行操作,以免試劑被污染。
(2) 必須確保使用的移液槍本身沒(méi)有殘留的支原體。
(3) 樣品前處理的各類吸頭、離心管,以及吸取陽(yáng)性對(duì)照DNA、待測(cè)樣品DNA的吸頭,務(wù)必小心處理,請(qǐng)將其裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的瓶子內(nèi),全部樣品吸取完后,蓋上瓶蓋,以防止陽(yáng)性DNA的揮發(fā),造成環(huán)境的污染,進(jìn)而造成假陽(yáng)性。整個(gè)操作過(guò)程,最好不要說(shuō)話,因?yàn)槿说目谇缓屯僖憾际菐егw的。
(4) 反應(yīng)后,請(qǐng)勿打開(kāi)反應(yīng)管的蓋子,否則有可能造成檢測(cè)環(huán)境的污染。結(jié)果判斷完后,將其用自封袋密閉后,進(jìn)行適當(dāng)處理。
3. 實(shí)驗(yàn)室必須嚴(yán)格分房間操作(本試劑盒建議在有窗戶、通風(fēng)良好的普通房間內(nèi)操作,請(qǐng)勿在密閉的房間操作。請(qǐng)勿在細(xì)胞培養(yǎng)間進(jìn)行該步驟的操作,因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)間支原體污染概率很高):
試劑配制房間1:專門進(jìn)行定量PCR體系的配制(建議該房間全部使用進(jìn)口濾芯吸頭。)
DNA提取房間2:專門進(jìn)行支原體DNA的提?。?/span>
DNA加樣房間3:專門進(jìn)行定量PCR體系配制后,添加待測(cè)樣品、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照等操作;
PCR擴(kuò)增房間4:進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增檢測(cè)。
注:如果房間緊張,可以考慮將房間2、房間3合并在一個(gè)房間,而房間1和房間4必須獨(dú)立。各房間物品(包括移液槍)均為專用,不得交叉使用。
4. 如果出現(xiàn)qPCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制時(shí)(qPCR結(jié)果:支原體通道和內(nèi)參對(duì)照通道均無(wú)擴(kuò)增曲線),可以采取以下幾種措施:
(1) 將取樣的時(shí)間提前到換液后2 d或3 d,此時(shí)細(xì)胞上清的PCR擴(kuò)增抑制物相對(duì)比較少,一般不會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的抑制。據(jù)我們測(cè)試,換液后5 d,PCR擴(kuò)增抑制物就已經(jīng)大量積累。
(2) 用PBS對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行離心清洗,去除樣品中的抑制物。具體方法如下:取1 mL細(xì)胞上清,先13000 rpm離心10 min,吸走950 μL上清;加PBS 950 μL,再次離心,吸走950 μL上清;再加PBS 950 μL,第三次離心,小心吸走全部上清(為避免碰到底部沉淀,可以保留底部3-5 μL液體),用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀,95 ℃加熱處理5 min,簡(jiǎn)單離心(1000 g,5 sec)后,取上清進(jìn)行檢測(cè)。但是該方法有如下缺點(diǎn):第一,如果樣品支原體含量較少,離心清洗可能導(dǎo)致漏檢,因?yàn)殡x心清洗過(guò)程中,可能導(dǎo)致支原體部分丟失。第二,個(gè)別樣品,即使經(jīng)過(guò)上述清洗也無(wú)法去除抑制劑。
(3) 抽提細(xì)胞上清的支原體DNA后再進(jìn)行PCR鑒定。
(4) 使用李記生物的Quick Cell支原體快速檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng)專用)(貨號(hào):AC16L061)或者Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):AC16L062)進(jìn)行檢測(cè),經(jīng)測(cè)試,未發(fā)現(xiàn)這兩種試劑盒會(huì)被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物所抑制。為了預(yù)防PCR的擴(kuò)增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制的問(wèn)題,也可以考慮將所有待測(cè)樣品全部進(jìn)行離心清洗或者DNA提取后,再使用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
5. 支原體檢測(cè)樣品可以分成兩類:第一類,用含血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞上清液,由于該條件非常適合支原體生長(zhǎng),培養(yǎng)數(shù)天后,支原體密度一般較高,可達(dá)107-9/mL,可以直接檢測(cè)。第二類,低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰*、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等樣品,由于這些樣品即使有支原體污染,支原體含量一般很少,直接使用快速支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè),往往檢測(cè)不出來(lái)。這些樣品建議:(1)對(duì)樣品的支原體進(jìn)行離心濃縮將支原體DNA濃縮提取,該兩種方法大約可以將檢測(cè)靈敏度繼續(xù)提高10-100倍。該方法速度快,當(dāng)天出結(jié)果,但是可靠性不如后面的培養(yǎng)法。(2)使用支原體液體培養(yǎng)基(必須同時(shí)接種不含精*酸和含精*酸的兩種支原體液體培養(yǎng)基)培養(yǎng)3-7 d后,再進(jìn)行檢測(cè)。具體方法請(qǐng)參考李記生物Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒(貨號(hào):AC16L062)說(shuō)明書中最后的注意事項(xiàng)部分。該方法速度較慢,需要3-7 d,但是可靠性高。
6. 如何提高本試劑盒檢測(cè)靈敏度:如果預(yù)期待測(cè)樣品支原體含量較少(比如,低溫保存的血清、臍帶血、胰*、抗生素、未使用的培養(yǎng)液、生物制品、極個(gè)別細(xì)胞培養(yǎng)上清等),可以采取以下幾種措施:(1)將支原體DNA濃縮提取后再進(jìn)行檢測(cè)(提取過(guò)程還可以把所有可能的PCR抑制劑全部去除),大約可以將檢測(cè)靈敏度提高10-100倍。(2)對(duì)支原體進(jìn)行離心濃縮:取1 mL細(xì)胞上清,先13000 rpm(約16000 g)離心10 min,吸走全部上清,用50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.0-8.8 重懸沉淀,95 ℃加熱處理5 min,簡(jiǎn)單離心后(1000 g,5 sec),取上清進(jìn)行檢測(cè)。該離心濃縮過(guò)程大約可以將檢測(cè)靈敏度提高20倍。(3)如果樣品是未經(jīng)提取的,可以通過(guò)增加反應(yīng)管中樣品DNA的加入量,比如由原來(lái)的2 μL增加到18 μL,如此可以提高檢測(cè)靈敏度9倍(沒(méi)有提取純化或者離心清洗的待測(cè)樣品,一般不能直接擴(kuò)大待測(cè)樣品體積,否則PCR被抑制的可能性將大幅度增加。)
7. 如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染,推薦使用李記生物的Quick Cell支原體祛除預(yù)防試劑盒(貨號(hào):AC16L066)、EZ 水浴鍋抑菌劑(貨號(hào):AC16L162)、EZ 細(xì)胞房除菌劑(貨號(hào):AC16L143)。產(chǎn)品詳情可咨銷或見(jiàn)官。
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