siRNA是目前基礎(chǔ)研究中常用的基因沉默(基因干擾)形式之一,方便快捷,在各種真核生物的基因功能研究,藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。常規(guī)siRNA產(chǎn)品為凍干粉形式的即用型試劑,-20°保存。進(jìn)行特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì),覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因,借助化學(xué)轉(zhuǎn)染技術(shù)適合進(jìn)行各種細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)。此外,通過對(duì)siRNA進(jìn)行特殊化學(xué)修飾,可以實(shí)現(xiàn)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)更加高效、特異、穩(wěn)定。
siRNA轉(zhuǎn)染原理
siRNA在細(xì)胞中降解mRNA的機(jī)制與miRNA類似(如上圖),合成的siRNA通過胞吞進(jìn)入細(xì)胞中,隨后少量的 siRNA 能夠發(fā)生溶酶體逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后siRNA與 Dicer 及 TRBP 形成 RISC復(fù)合物,RISC復(fù)合物招募 AGO2,隨后正義鏈被降解,siRNA 反義鏈與互補(bǔ)配對(duì)的 mRNA 序列結(jié)合,接著 AGO2 對(duì)mRNA 進(jìn)行切割,最終引起 mRNA 的降解。
siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)步驟(下面以 24 孔板為例,其他培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)染可以咨詢李記生物)
1、接種細(xì)胞
對(duì)于貼壁細(xì)胞:轉(zhuǎn)染前一天,將細(xì)胞按照每孔1-2x10^5個(gè)細(xì)胞的量進(jìn)行鋪板,使其在轉(zhuǎn)染時(shí)密度為60%-80% 為佳。
對(duì)于懸浮細(xì)胞:轉(zhuǎn)染當(dāng)天,配制轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物之前,用PBS清洗細(xì)胞1-2次,用250 μL Opti-MEM I 減血清培養(yǎng)基 (無血清) 重懸細(xì)胞,在24孔板中進(jìn)行細(xì)胞鋪板,細(xì)胞密度為60-80%。
2、準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物(或轉(zhuǎn)染試劑-miRNA復(fù)合物)
(1)對(duì)于每孔細(xì)胞,取2 μLsiRNA (20 μM,DEPC水溶解)加入到1.5mL離心管中,加入2 μL轉(zhuǎn)染試劑與siRNA 混合,室溫孵育3 min。
(2)往上述混合物中加入100 μL Opti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清),輕輕混勻,在室溫下靜置30 min,形成轉(zhuǎn)染試劑-核酸復(fù)合物。
(3)30 min后,往上述復(fù)合物中加入250 μLOpti-MEM I減血清培養(yǎng)基(無血清),輕輕混勻。
3、轉(zhuǎn)染細(xì)胞
(1)細(xì)胞用PBS清洗1-2次,將上述350µL轉(zhuǎn)染試劑-siRNA復(fù)合物加入每孔細(xì)胞。
(2)在 37℃,5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24-48 h,無需更換新的培養(yǎng)液,之后即可檢測(cè)基因干擾效果或者后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。注:可在轉(zhuǎn)染12h后補(bǔ)充500 μL培養(yǎng)基。
siRNA轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證
siRNA沉默效果分析siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,siRNA 在 細(xì)胞內(nèi)一系列酶的作用下形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物,識(shí)別并切割靶基因mRNA,誘發(fā)宿主細(xì)胞針對(duì)這些mRNA的降解反應(yīng), 從而抑制了細(xì)胞內(nèi)目的基因蛋白的表達(dá),一般可從兩個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)。
• mRNA 水平 - QPCR檢測(cè)
siRNA的作用機(jī)理在于其引起靶基因mRNA的降解,因此mRNA的降解水平是siRNA 沉默效率的直接證明。一般在siRNA轉(zhuǎn)染后24小時(shí)后即可檢測(cè)到靶mRNA水平的降低,可采用細(xì)胞總RNA提取,全長(zhǎng)cDNA合成,熒光定量實(shí)驗(yàn)即可檢測(cè)到mRNA 的敲除效率。
• 蛋白水平 - WB檢測(cè)
siRNA引起靶基因mRNA的降解,從而影響了靶蛋白的表達(dá)。但蛋白水平檢測(cè)時(shí)間受細(xì)胞內(nèi)目的蛋白表達(dá)量、穩(wěn)定性、半衰期、甚至其他調(diào)控等因素的影響,蛋白質(zhì)水平下降的幅度與mRNA水平下降不一定成線性正比關(guān)系。一般在轉(zhuǎn)染后48后開始WB檢測(cè),72,96 小時(shí),甚至更長(zhǎng)時(shí)間之后多點(diǎn)采樣。
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