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和元李記雙熒光素酶產(chǎn)品推薦
— 實驗原理 —
螢火蟲熒光素酶是一種分子量約為61KD的蛋白,在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下,可以催化Luciferin 氧化成Oxyluciferin,在Luciferin 氧化的過程中,會發(fā)出生物熒光。
圖1.螢火蟲熒光素酶催化反應(yīng)原理
海腎熒光素酶是一種分子量約為36KD的蛋白,在氧氣存在的條件下,可以催化Coelenterazine 氧化成Coelenteramide,在Coelenterazine 氧化的過程中也會發(fā)出生物熒光。
圖2.海腎熒光素酶催化反應(yīng)原理
雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)在細胞中同時表達螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶,螢火蟲熒光素酶作為報告基因反應(yīng)目的基因表達的改變,海腎螢光素酶作為內(nèi)參基因,提供轉(zhuǎn)錄效率的對照(減少內(nèi)在變化因素如培養(yǎng)細胞的數(shù)目,細胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率對實驗準確性的影響)。兩種熒光素酶沒有種屬同源性并對應(yīng)不同的反應(yīng)底物,故而沒有交叉干擾。
— 應(yīng)用方向 —
一、靶基因驗證
miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用(降解或抑制翻譯),將目的基因3’UTR(野生型和結(jié)合位點突變型)序列構(gòu)建至載體中報告基因Luc的3’端,通過比較過表達miRNA后,報告基因表達的改變(螢光素酶的活性下降還是不變),明確miRNA的作用及miRNA與靶基因3’UTR的作用位點。
圖3.靶基因驗證實驗設(shè)計原理
相關(guān)實驗適用類型:miRNA-靶基因(mRNA、LncRNA、circRNA)、m6A位點、增強子
二、啟動子活性驗證
轉(zhuǎn)錄因子主要通過作用于靶基因的啟動子起作用,將目的基因啟動子區(qū)序列構(gòu)建在報告基因Luc的5’端,通過共表達轉(zhuǎn)錄因子后,根據(jù)報告基因表達的改變,來確定轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子結(jié)合位點及對靶基因的作用。
圖4.啟動子驗證實驗設(shè)計原理
— 應(yīng)用示例 —
1、示例一
文章標題:METTL14/miR-29c-3p axis drives aerobic glycolysis to promote triple-negative breast cancer progression though TRIM9-mediated PKM2 ubiquitination
發(fā)表期刊:Journal of cellular and molecular medicine
和元助力:將WT TRIM9-3’UTR 和突變型 TRIM9-3‘UTR 構(gòu)建至pMIR-REPORT載體,通過共轉(zhuǎn)染miR-29c-3p mimics, miR-29c-3p inhibitor和 miRNA-NC,明確了miR-29c-3p與TRIM9的結(jié)合。
2、示例二
文章標題:The ELAVL3/MYCN positive feedback loop provides a therapeutic target for neuroendocrine prostate cancer
發(fā)表期刊:Nature communications
和元助力:為了闡明MYCN轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制,作者分別將ELAVL3的全長以及Segments A, B, C的啟動子構(gòu)建到luciferase報告基因載體上。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒l(fā)現(xiàn)MYCN顯著上調(diào)full-length ELAVL3和ELAVL3 Segment A兩組的luciferase信號,證明了MYCN對 ELAVL3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
3、示例三
文章標題:METTL3 facilitates stemness properties and tumorigenicity of cancer stem cells in hepatocellular carcinoma through the SOCS3/JAK2/STAT3 signaling pathway
發(fā)表期刊:Cancer gene therapy
和元助力:SOCS3的CDS區(qū),包含m6A識別位點野生型(GGACU)以及突變型(CCTGA),被構(gòu)建在pMIR-REPORT載體上。通過過表達和干擾METTL3的表達,同時利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了METTL3和SOCS3的相互作用。
/ 雙熒光素酶活動 /
活動時間:即日起--6月28日
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活動范圍:全國生物相關(guān)終端客戶
kai獎時間:2024年6月28日13:00
領(lǐng)取方式:3個工作日內(nèi)聯(lián)系梁經(jīng)理兌獎,逾期視為自動放棄
注意事項:
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4、活動最終解釋權(quán)歸和元李記所有。
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