BCA (Bicinchoninic acid) 法是目前應用比較廣泛的蛋白質濃度測定方法。基于雙縮脲反應,即在堿性環(huán)境下蛋白質將Cu2+還原成Cu+,Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物,在562 nm處有高的吸光值,該反應產物的量與蛋白質濃度成正比。測定其在562 nm處的吸光值,并與標準曲線對比,即可計算待測蛋白的濃度。該方法快速靈敏、穩(wěn)定可靠且對不同種類蛋白質變異系數很小。試劑盒中提供了濃度穩(wěn)定的蛋白標準品用于制作標準曲線。
BCA 蛋白定量試劑盒可用于試管法檢測,也可用于微孔板法檢測。試管法需較大量蛋白樣品(100 μL)和工作液(2 mL),蛋白樣品與 BCA 工作液的比率為1:20(v/v),蛋白質測定范圍為20-2000 μg/mL,采用加強法可以檢測到 5 μg/mL;微孔板法操作簡單方便,僅需少量(10-25 μL)的蛋白樣品和工作液(200 μL),蛋白樣品與工作液的比率為1:20(v/v)或者1:8(v/v),蛋白質測定范圍為 20-2000 μg/mL,采用加強法可以檢測到 5 μg/mL。
BCA蛋白定量試劑盒價格是多少?
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BCA蛋白定量試劑盒使用方法
一、配制標準品和工作液
1. 配制 BSA 標準品體系(線性范圍20-2000 μg/mL或者5-250μg /mL標準品制備各2種配置方法,請根據習慣選用恰當方式)?!咀ⅰ浚築SA 標準品濃度為2 mg/mL,稀釋液為蛋白樣品的溶解液,原則上蛋白樣品在什么溶液中,標準品也宜用什么溶液稀釋。但也可用水或 1 X PBS 進行稀釋。
BSA 標準品體系配制表(配制后可放置于4℃ 冰箱多次使用)
表1.微孔板檢測BSA 標準品體系配制(線性范圍 20-2000 μg/mL)配置方法一
Vial | 稀釋液體積(μL) | BSA標準品體積(μL) | BSA終濃度(μg/mL) |
A | 0 | 100 | 2000 |
B | 25 | 75 | 1500 |
C | 50 | 50 | 1000 |
D | 83 | 50 | 750 |
E | 75 | 25 | 500 |
F | 140 | 20 | 250 |
G | 150 | 10 | 125 |
H | 158 | 2 | 25 |
I | 100 | 0 | 0=Blank |
表2.微孔板檢測BSA 標準品體系配制(線性范圍 20-2000 μg/mL)配置方法二
Vial | 稀釋液體積(μL) | BSA標準品體積(μL) | BSA終濃度(μg/mL) |
A | 0 | BSA 標準液100 | 2000 |
B | 25 | BSA 標準液75 | 1500 |
C | 65 | BSA 標準液65 | 1000 |
D | 35 | Vial B 35 | 750 |
E | 65 | Vial C 65 | 500 |
F | 65 | Vial E 65 | 250 |
G | 65 | Vial F 65 | 125 |
H | 80 | Vial G 20 | 25 |
I | 80 | 0 | 0=Blank |
表3.BSA標準品體系(微孔板檢測,線性范圍 5-250μg /mL)配置方法一
Vial | 稀釋液體積(μL) | BSA標準品體積(μL) | BSA終濃度(μg/mL) |
A | 70 | 10 | 250 |
B | 75 | 5 | 125 |
C | 78 | 2 | 50 |
D | 79 | 1 | 25 |
E | 399 | 1 | 5 |
F | 80 | 0 | 0 |
表4.BSA標準品體系(微孔板檢測,線性范圍 5-250μg /mL)配置方法二
Vial | 稀釋液體積(μL) | BSA標準品體積(μL) | BSA終濃度(μg/mL) |
A | 70 | BSA 標準液10 | 250 |
B | 40 | Vial A 40 | 125 |
C | 45 | Vial B 30 | 50 |
D | 40 | Vial C 40 | 25 |
E | 40 | Vial D 10 | 5 |
F | 40 | 0 | 0 |
2. 配制 BCA工作液
(1) 計算所需要的總BCA 工作液體積。總BCA工作液體積=(標準品數量+待測樣品數量)x重復數x每個樣品所需要的BCA 工作液。【注】:試管法檢測時每個樣品加 2.0 mL BCA 工作液,微孔板檢測每個樣品加200 μL BCA 工作液。
(2) 配制BCA工作液:50 體積的BCA 試劑 A 中加入1 體積的BCA 試劑B(A:B=50:1),充分混勻?!咀ⅰ浚築CA工作液裝入密封容器內,室溫條件24h 穩(wěn)定。
二、檢測方法
1. 試管檢測方法(樣品:BCA工作液=1:20)
(1) 各取100 μL 標準品和待測樣品加入到反應管中。
(2) 每管加入2.0 mL BCA 工作液,混勻。根據待測樣品的濃度范圍選擇孵育時間和溫度。
標準孵育方法:37℃ 孵育30 min 或者室溫2h(檢測范圍:20-2000 μg/mL)
增強孵育方法:60℃ 孵育30 min(檢測范圍:5-250 μg/mL)
【注】:BCA 檢測蛋白濃度,延長孵育時間會加深顏色反應。升高溫度會加快顯色反應,但是溫度升高和時間延長會降低檢測下限,以及降低工作線性范圍。若蛋白濃度很低,可在較高溫度孵育或者適當延長孵育時間。
(3) 冷卻到室溫。在分光光度計上進行檢測,設定波長為 562 nm,在10 min內對所有樣品讀數?!咀ⅰ浚河捎贐CA 反應達不到真正的反應終點,即使溫度降低至室溫生色反應液會繼續(xù)。但是,由于室溫下生色比率相當低,因此若是10 min 內能對所有的樣本進行 562 nm 吸光度的測試,不會導致明顯錯誤。
(4) 根據BSA 標準品的吸光度(減去標準品中空白孔的OD 值即最終的讀數),繪制標準曲線(X-蛋白濃度μg/mL;Y-最終的OD 562nm)。依據標準曲線和樣品的稀釋倍數計算樣品蛋白濃度。
2. 微孔板檢測方法(樣品: BCA工作液=1:20)
(1) 各取10 μL標準品和待測樣品加入到微孔板中?!咀ⅰ浚簶悠放c工作液比例為1:20,檢測范圍為125-2000 μg/mL。若樣品濃度非常低,可使用25μL 標準品和待檢測樣品進行檢測(即1:8),這時試劑盒的檢測范圍為 20-2000 μg/mL。
(2) 每孔加入200 μL BCA 工作液,槍頭吹打充分混勻。蓋上微孔板,37℃ 孵育30 min。
(3) 冷卻到室溫,在酶標儀上的562 nm 波長范圍處檢測吸光度。
(4) 根據BSA標準品的吸光度(減去標準品中空白孔的OD值即最終的讀數),繪制標準曲線( X-蛋白濃度μg/mL;Y-最終的OD 562nm)。依據標準曲線和樣品的稀釋倍數計算樣品蛋白濃度。
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